Дослідження плацент породіль і тварин починалося з огляду. До морфометричних показників відносили: масу плацент, її розміри, діаметр і об’єм плацент. Вимірювалася маса плодів і новонароджених, їх довжина тіла, обчислювався відносний показник: маса плаценти/маса плоду, або новонародженого і, відповідно, – плацентарно–плодовий коефіцієнт. Вимірювали товщину плодової і материнської частини.
Для гістологічного дослідження брали шматочки плаценти породіль розмірами 2х2 см з центральної зони плаценти, а плаценти тварин забиралися повністю. Отриманий матеріал від людини фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну (pH 7,0), при кімнатній температурі протягом 5–6 діб, або у рідині Карнуа. Анатомо–експериментальний матеріал фіксували в розчині Буена, абсолютному спирті і розчині Карнуа. Виготовляли 150–200 серійних зрізів, товщиною 5 мкм.
Для оглядової мікроскопії проводили фарбування зрізів гематоксиліном і еозином, ШЙК–реакцію з додатковим фарбуванням ядер гематоксиліном Караці. Підраховували абсолютну площу, що припадає на строму ворсин, цито– і синцитіотрофобласт, синцитіальні вузли і материнські лакуни в плаценті людини на 10000 мм2. Проводили гістометрію – підрахували відносну площу, що припадає на відкладання фібриноїду, материнські лакуни, плодові судини і сполучнотканину строму трабекул плаценти щурів. Для вивчення розподілу фібриноїду фібринового і матриксного типу гістологічні зрізи фарбували за Маллорі. Для специфічного виявлення вуглеводного компоненту композитів фібриноїду проводили лектингістохімічну реакцію з набором лектинів: кори бузини чорної (SNA), зародків пшениці (WGA), сої (SBA), ікри окуня (PFA), арахісу (PNA).
Для вивчення особливостей розподілу колагенів в плацентарних структурах проводили імпрегнацію сріблом за Лейдлоу. Лектингістохімічним методом досліджували розподіл колагенів III, V і VI типів з використанням комерційного набору „Лектинтест” (м. Львів). Для імуногістохімічного дослідження колагену ІV типу (n=40) використовували первинні антитіла (DAKO) і систему візуалізації LSAB (Labelled Streptavidin-Biotin).
Для дослідження відкладень антирезусних імунних комплексів на поверхні ворсин цитотрофобласту застосовували лектингістохімічний метод, з використанням лектину еритроаглютинину. Площу відкладень антирезусних комплексів вираховували на площу 10000 мкм2. Кількісну оцінку результатів лектингістохімічної реакції проводили методом комп’ютерної морфометрії та мікроденситометрії за допомогою ліцензійної копії комп’ютерної програми „Відеотест – Размер 5.0” (ООО Видеотест, Россия).
Для вивчення дендритних клітин лімфоїдної тканини, асоційованої з плацентою, шматочки плаценти фіксували у випарах рідкого азоту. Виготовляли кріостатні зрізи товщиною 10 мкм, виявляли дендритні клітини за допомогою реакції на АТФ–азу (за методом Вахштейна–Мейзеля). Одночасно, дендритні клітини виявляли за допомогою лектинів сочевиці (LCA) і конконоваліну А (Con A).
Для кількісного і якісного вивчення лімфоцитів плаценти, використовуючи морфометричну сітку Глаголєва в модифікації С.Б. Стефанова, підраховували загальну кількість лімфоцитів в децидуальній пластинці матки і в стромі ворсин хоріальної частини плаценти на умовну одиницю площі 10000 мкм2 при імерсійному збільшені мікроскопа (об. 100, ок.10). Для виявлення цитотоксичних лімфоцитів використовували альціанове забарвлення при критичній концентрації електроліта MgCl2 0,6М. Для вивчення розподілу плазматичних клітин проводили фарбування за Браше. Для виявлення лімфоцитів, які фенотипічно розрізняються за вуглеводними залишками, проводили дослідження із застосуванням лектинів арахісу (PNA), сої (SBA) та слимака (HPA).
Для дослідження популяції цитотоксичних лімфоцитів в плаценті аналізували рівень експресії маркера СD8+ на лімфоцитах (n=50); популяції В1–лімфоцитів – маркер СD5+ (n=75) в імуногістохімічних реакціях з моноклональними антитілами виробника DakoCytomation (Denmark – USA).
Мікрофотографування досліджуваних об’єктів виконано на відеосистемі „Aksiolap” (“Carle Ceis”, Німеччина).
Облік морфологічних ознак проводили методом морфологічного урахування структур за С.Б. Стефановим. Статистичну обробку отриманих числових результатів проводили методами варіаційної статистики. Для перевірки наявності зв’язку між перемінними, які були отримані, застосували кореляційний аналіз (коефіцієнт кореляції Пірсона). Достовірність різниці між групами оцінювали за методом Стьюдента–Фишера для порогу вірогідності результатів не менше 95%, що є загальноприйнятою в біологічних і медичних розрахунках (р<0,05).
Результати дослідження та їх аналіз. При досліджені морфо–функціональних змін в системі "мати–плацента–плід", внаслідок антигенної стимуляції протягом третього періоду вагітності і при ізоімунній несумісності по резус фактору, встановлено, що вони залежать від реактивності імунної системи материнського і плідного організмів.
Плаценти групи жінок, які мали антигенний вплив протягом третього періоду вагітності і резус–несумісність, частіше, ніж у контролі, мали неправильну форму. У породіль з антигенним впливом виявлялось зростання середньої маси плацент 506,1±11,58 г, в групі порівняння – 486,0±16,41 г і збільшення товщини плодової частини плаценти до 16,50±1,00 мм; при резус–несумісності відбувалося збільшення її площі 349,5±1,66 мм2, в групі порівняння 331,98±14,71 мм2 і потовщення материнської частини плаценти до 14,50±1,10 мм. В першій групі спостереження, після антигенного впливу на організм вагітної, відбувалося зменшення площини лакун до 445,72±45,58 мм2, в другій групі порівняння цей показник становив 524,82±9,68 мм2.
Материнські поверхні плацент жінок з резус–несумісністю часто мали неправильну форма. Товщина, розміри і розташування часточок відрізнялися значною варіабельністю.
При порівнянні гістологічних особливостей базальної пластинки першої групи і другої групи спостереження відзначено, що більшість плацент жінок (95 %) після антигенного тиску протягом третього періоду вагітності мають осередкові скупчення лімфоцито–макрофагальних клітин. В групі порівняння вони також є, але розташовуються дифузно, навколо якірних ворсин. Основна відпадна оболонка плацент третьої групи спостереження (резус–несумісність) рівномірно кровонаповнена і містить велику кількість фібриноїду.
В плаценті жінок з антигенною дією протягом третього періоду в товщі хоріоничної пластинки доволі часто виявляються осередки лейкоцито–лімфоцитарних інфільтратів (75 %, проти 40 % у контролі). Шар Лангханса хоріонічної пластинки є потовщеним (у 80 % випадків, проти 45 % у групі порівняння). При ізоімунній несумісності по резус–фактору він також представлений товстим шаром фібриноїда і хоріонічна пластинка завжди має нерівномірну товщину.
Проявом компенсаторно–пристосувальних механізмів в плаценті, на тлі дії антигенів на організм вагітної і зростання кількості лімфоцитів в ній, є зміна форми ворсин. Вони мають виражені вигини контурів, які включають численні опуклості та інвагінації, що надає таким ворсинам виду неправильної, зім’ятої форми. Одночасно такі ворсини є багатими на лімфоцити малого діаметру, особливо в прошарку синцитія.
Абсолютна площа, яка припадає на синцитіо– і цитотрофобласт в першій групі жінок (антигенний тиск на вагітну протягом останнього триместру вагітності), становить 343,06,±67,68 мм2 абсолютної площі, в другій групі порівняння – 358,32±26,37 мм2. Абсолютна площа, що припадає на синцитіальні вузли в третій групі (резус–несумісність), становить 152,59±16,27 мм2, в контролі (четверта група) – 174,19±15,29 мм2.
Площа нашарувань антирезусних імунних комплексів в плацентах при резус–несумісності становить 240,76±23,09 мкм2. В плацентах групи порівняння – 182,62±23,56 мкм2. При порівнянні щільності таких нашарувань в одиницях яскравості, в третій групі цей показник становить – 308,55±45,09 одиниць, а в контролі – 152,34±34,00 одиниць.
Останнім часом особлива увага морфологів, ембріологів, клініцистів приділяється процесу колагенезу в плаценті (Ситнікова В.О., 2004). При досліджені накопичення колагенових волокон, пофарбованих за Маллорі, встановлено, що в плацентах з антигенним впливом, в більшості випадках, волокна розрихлені, розпушені і потовщені.
У плацентах жінок з фізіологічним перебігом вагітності і без резус-несумісності колагенові волокна при виявленні їх імпрегнацією азотнокислим сріблом за Лейдлоу мають вигляд лінійних, довгих, звивистих волокон світло–коричневого кольору, товщиною до 5 мкм. Волокна світло–коричневого кольору ідентифікуються як колаген І типу. В стромі стовбурових ворсин вони щільно прилягають одне до одного, утворюючи пучки.
При дослідженні плацент породілей з вірогідним антигенним впливом, встановлено, що в стромі ворсин зростає експресія колагену I типу (++), порівняно з плацентами жінок другої групи (+). Спостерігається огрубіння цих волокон, щільність їх зростає, окремі волокна майже не розрізняються. Нерівномірне потовщення і огрубіння волокон колагену I типу також спостерігається в децидуальній пластинці.
При дослідженні розподілу колагену III типу за Лейдлоу в плацентах з фізіологічним перебігом вагітності, його волокна є тонкими і ніжними, порівняно з волокнами колагену I типу. Вони злегка звивисті, чорного кольору, товщиною до 1 мкм, радіально розташовані в товщі стінок судин стовбурових ворсин. В децидуальній пластинці вони локалізуються навколо судин і утворюють дрібнопетельний візерунок.
У жінок першої групи – з обтяжливим діагнозом, експресія колагену III типу в плаценті переважає (++), порівняно з плацентами жінок контрольної групи (+). Волокна, частіше, ніж в нормі, потовщені; спостерігається їх фрагментація, розщеплення та огрубіння. В децидуальній пластинці волокна чорного кольору зберігають петельний малюнок в стінках судин. Отримані дані співпадають з клінічними даним інших авторів (Назаренко Л.Г., Неєлова О.В., 2006; Задорожна Т.Д., Жук В.Ю., 2007).
При дослідженні колагену III типу лектингістохімічним методом встановлено, що топографія волокон співпадає з локалізацією волокон чорного кольору після імпрегнації сріблом. Оскільки приєднання лектину окуня після гідролізу відбувається до рецепторів–лігандів, розташованих на глікопротеїновій оболонці колагену III типу, волокна мають більш потовщений, огрубілий вигляд, ніж після імпрегнації сріблом, і завтовшки 3–5 мкм. Збільшення накопичення, ніж в нормі, колагену III типу просліджується в плацентах жінок першої і третьої груп (++, +++, відповідно). PFA+–волокна колагену III типу мають товщину до 7 мкм. Найчастіше вони фрагментовані й мають розщеплений характер.
При вивченні розподілу колагену IV типу, імуногістохімічним методом при фізіологічно перебігаючій вагітності встановлено, що інтенсивне накопичення колагену визначається в базальній мембрані судин ворсинчастого трофобласту (+++), базальній мембрані епітелію синцитіотрофобласту (+++), у складі міжворсинчатого фібриноїду та стромі ворсин, особливо стовбурових. В структурі базальної мембрани судин хоріону колаген IV типу нашаровується у вигляді суцільної смужки, товщиною 1,5–2 мкм. В товщі базальної мембрани синцитіотрофобласту утворює суцільну смугу, товщиною 2-3 мкм, яка має нерівний, розшарований контур.
У складі міжворсинчастого фібриноїду, який нашаровується на поверхні ворсин, колаген IV типу має вигляд аморфних мас. Особливо інтенсивне відкладання колагену IV типу у складі фібриноїду відбувається на поверхні синцитіокапілярних мембран.
У плацентах першої групи (інфекційний процес у жінок протягом третього періоду вагітності) в структурі мембран синцитіотрофобласту колаген IV типу виявляється у вигляді грубих, розволокнених смужечок, порівняно з другою групою плацент. В місцях синцитіальних вузлів колаген IV типу відсутній в структурі базальних мембран. У складі фібриноїду ворсинчастого хоріону і основної відпадної оболонки інтенсивність накопичення колагену IV типу вища, порівняно з контрольною другою групою (+++).
У разі вивчення розподілу колагену V типу лектингістохімічним методом, встановлено, що топографія тоненьких (до 1 мкм завтовшки), звивистих, довгих, світло–коричневих SBA+–волокон співпадає з локалізацією волокон коричневого кольору після імпрегнації сріблом. В сполучнотканинній стромі стовбурових ворсин вони локалізуються навколо стінок судин, або вільно, неупорядковано розташовуються в сполучній тканині. В проміжних ворсинах вони ще тонші, звивисті і їх можна підраховувати (8–10 волоконець). В термінальних ворсинах їх або не видно, або вони ледь контуруються. В децидуальній пластинці майже не візуалізуються SBA+–волокна, але вони добре ідентифікуються в стромі якірних ворсин. В плацентах жінок після перенесеного гострого респіраторного захворювання протягом третього періоду вагітності інтенсивність експресії колагену V типу дещо вища.
При виявленні розподілу колагену VI типу лектингістохімічним методом у плацентах з фізіологічним перебігом вагітності встановлено, що LCA+–волокнисті структури зустрічаються в сполучній тканині ворсин і мають вигляд коричневих уривчастих смужечок. В децидуальній пластинці вони мають павутиноподібний вигляд. При резус–несумісності колагенові LCA+–волокна VI типу мають темніший колір (коричневий) на поверхні синцитіокапілярних мембран (+++), порівняно з контрольною групою (+).
У породілей з антигенним впливом протягом третього періоду вагітності і резус-несумісністю спостерігається надлишковий, порівняно з нормою, синтез колагенів I, III, V і VI типів у плацентарних структурах, що сприяє прискореному старінню плаценти. Посилення фібрилоутворення в плаценті відбувається на фоні зростання кількості лімфоцитів в плодовій і материнській частинах плаценти.
Підтвердженням ролі лімфоїдної тканини в процесі морфогенезу плаценти є закономірність зміни морфології плацент на тлі зростання лімфоцитів в плаценті протягом третього періоду вагітності у тварин. В лабіринтній частині плаценти протягом третього періоду вагітності щурів спостерігається стоншення гемато-плацентарного бар’єру за рахунок деструкції цито– і синцитіотрофобластичного прошарку клітин сполучної зони плаценти. З 18–ї доби вагітності і до пологів відносна площа, що займають клітини трофобласту, становить 31,87±0,34 % і 16,43±1,33 %, відповідно.
Імунізація вагітних тварин стафілококовим анатоксином призводить до змін в морфогенезі плаценти і плоду протягом третього періоду вагітності. Маса і товщина плацент експериментальної групи на 18–у добу становить 0,36±0,03 г і 9,30±1,10 мм. Дані показники менші від показників групи контролю (0,65±0,01 г; 16,40±3,10 мм, відповідно), що призводить до порушення трофічної функції плаценти і зниження маси і довжини тіла у плодів (1,68±0,12 г, 24,00±1,20 мм – в нормі, 0,80±0,03 г, 21,00±2,30 мм – в експерименті). Зміни в морфогенезі плаценти компенсуються зростанням її діаметру протягом всіх строків спостереження, порівняно з контрольною групою, що можна вважати компенсаторно–пристосувальною реакцією. Різниця в морфологічних показниках новонароджених практично нівелюється, але порушується механізм пологів, які стають невчасними. Порушення пологів відбувається на фоні більш прискореного потоншання шару клітин сполучної зони протягом третього періоду вагітності, відкладання більшої кількості фібриноїдних нашарувань в материнських лакунах, що змінює структуру гемато–плацентарного бар’єру.
Внутрішньоплідне уведення імуноглобуліну плодам на 18–у добу вагітності призводить до змін у морфо–функціональному стані плаценти. На 20–у добу вагітності, плаценти мають більшу масу (0,91±0,03 г; в нормі – 0,89±0,06 г); більший діаметр (18,33±1,12 мм; в нормі – 13,92±1,16 мм), але меншу товщину (9,00±1,00 мм; в нормі – 13,20±0,30 мм), що призводить до перевищення показників маси і довжини тіла у плодів порівняно з контролем. Наприкінці вагітності, навпаки, всі морфологічні показники плаценти і плодів відстають від показників контрольної групи. Виявлені зміни плаценти супроводжуються стрімкою інволюцією шару „глікогенових” клітин і шару гігантських трофобластичних клітин, значним накопиченням материнського фібриноїду в лакунах на час пологів (28,33±9,06 % та 21,86±1,76 % в нормі), що призводить до змін у структурі гемато–плацентарного бар’єру та закінчується невчасними і десинхронізованими пологами.
Формування толерогенних фето–плацентарно–материнських взаємовідносин залежить від біологічного бар’єру, центральне місце в якому посідає лектинрецепторна система трофобласту, що корелює зі змінами в функціюванні різних відділів імунної системи плаценти протягом третього періоду вагітності. В децидуальній пластинці зростає кількість цитотоксичних HPA+–лімфоцитів, SBA+–В–лімфоцитів і плазматичних клітин материнського походження; в сполучній зоні плаценти збільшується число цитотоксичних HPA+–лімфоцитів плідного походження.
Залежно від динаміки вагітності змінюється топографія і функції фібриноїду, як механічного бар’єру для адгезії клітин або адсорбції речовин. Трофобласт вкрито шаром фібриноїду, який має складну молекулярну, хімічну і стереохімічну будову. Імунозахисні функції фібриноїда визначаються якісним і кількісним складом речовин, що входять до його композитів – фібрином, фібронектином, ламініном, тенесцином, анексином, гепаран–сульфатом, протеогліканами, колагенами I, II, III, IV і V типів (Милованов А.П., 1999). В складі цих речовин є вуглеводвміщуючі біополімери, які забезпечують різні адгезивні властивості фібриноїду, ступінь компактності і просторову структуру його нашарувань. Вуглеводна композиція речовин, що входить до відкладань фібриноїду в материнських лакунах, в плодових судинах, на межі материнської і плодової частини плаценти та в децидуальній пластинці відтворює імуноморфологічні взаємовідносини в системі мати–плацента–плід.
Маскування антигенів клітин трофобласта шаром сіалоглікопротеїдів блокує аферентну ланку імунної реакції з боку материнського організму, в той час як шар фібриноїда, що фіксує антитрофобластичні антитіла і сенсибілізовані лімфоцити матері, і виключає еферентну ланку імунної відповіді. Зовнішня поверхня трофобласта, що вкрита фібриноїдом, стає замаскованою і одночасно адгезивною, що сприяє зв’язуванню біополімерними молекулами рецепторів лімфоцитів, з подальшою їх інактивацію і відміною розвитку імунологічних реакцій з трофобластом.
Фібриноїд плаценти переважно складається із фібрину – глікопротеїну, у якого вуглеводна частина закінчується сіаловими кислотами, що є лігандом для лектину кори бузини чорної (SNA). Маскування рецепторів клітин трофобласту сіаловими кислотами захищає їх від різних руйнуючих факторів та забезпечує механізм формування імунного неспецифічного бар’єру в плаценті. Одним із агресивних факторів по відношенню до клітин трофобласту є дія материнських цитотоксичних лімфоцитів лакунарної крові і децидуальної пластинки, які проявляють тропність до рецепторів, що вміщують сіалові кислоти. Тому, у тварин експериментальної групи після імунізації вагітних стафілококовим анатоксином, інтенсивність накопичення рецепторів до лектину кори бузини чорної в структурі фібриноїдних мас збільшується в децидуальній оболонці і в сполучній зоні плаценти, що співпадає із зростанням загальної чисельності лімфоцитів.
При відсутності неспецифічного бар’єру фібринового походження на поверхні клітин трофобласту, імуноадсорбуючу функцію по відношенню до лімфоцитів виконують вуглеводні залишки рецепторів–інтегринів тенесцину і анексину. Вуглеводні залишки тенесцину і анексину V, які виявляються лектином пшениці (WGA), вибірково адгезують NK–клітини, В–лімфоцити, активовані Т–лімфоцити (Erickson H.P., 1994; Cong-xiao Gao et al., 2005). Кількість та інтенсивність нашарувань WGA+–походження корелює із загальною кількістю лімфоцитів в децидуальній пластинці і в шарі гігантських трофобластичних клітин. У тварин експериментальної групи чисельність і щільність WGA+–нашарувань в децидуальній пластинці і в перехідній зоні більша, ніж у тварин контрольної групи.
Сорбція імуноглобулінів та імунних комплексів в фібриноїдних масах діагностується за SBA+–відкладаннями, тому що вуглеводні залишки конститутивних фрагментів імуноглобулінів проявляють специфічність до лектину сої (SBA). У тварин імунізованих стафілококовим анатоксином, щільність рецепторів до лектину сої збільшується порівняно з тваринами контрольної групи в фібриноїдних депозитах кожної окремої локалізації. Таким чином, накопичення SBA+–субстанцій в різних відділах плаценти на базальних мембранах відтворює інтенсивність адгезії імуноглобулінів та імуноглобулінових комплексів і корелює із кількістю В–лімфоцитів. Зростання кількості В–лімфоцитів
8-09-2015, 22:05