З метою дослідження магістральних судин нижніх кінцівок визначали наявність та характер пульсації на магістральних артеріях. Отримані дані підтверджували доплерографією артерій нижніх кінцівок та доплерометрією.
Для об'єктивної оцінки швидкості загоєння рани проводили планіметрію за методикою Л. Н. Попової і цитологічне дослідження мазків–відбитків з ранової поверхні в динаміці за методом М. П. Покровської і М. С. Макарова в модифікації Д. М. Штейнберга (Б. М. Даценко, 1995). На підставі клінічного аналізу крові обчислювався лейкоцитарний індекс інтоксикації за Я. Я. Кальф–Каліфом (1941).
Визначалися кількісні та якісні показники ранової мікрофлори, а також чутливість виділених мікроорганізмів in vitro до антибактеріальних препаратів з використанням стандартних дисків на щільних живильних середовищах.
Статистична обробка отриманих результатів проводилася на комп’ютері на базі процесора Celeron з використанням пакета статистичних програм для медико–біологічних досліджень ”Biostatistics” (StatisticalGraphicsCorp., USA), Version 4.03. Отримані цифрові результати обробляли за допомогою критерію Стьюдента, Пірсона. Усі використані при виконанні роботи одиниці вимірів і параметри приведені у відповідність з міжнародною системою одиниць.
Результати та їх обговорення. Процеси апоптозу при гнійно–запальних процесах на фоні експериментального цукрового діабету . Об'єктом досліджень була тканина м`язів стегна 174 дорослих безпородних білих щурах–самцях масою 250–310 г.
Початковій рівень цукру в крові складав (4,8 ± 0,05) ммоль/л, через 1 добу після введення тваринам аллоксана він підвищився до (17,9 ± 0,13) ммоль/л. З моменту введення інсуліну вміст цукру в крові коливався від 9,7 до 11,0 ммоль/л.
Рівень апоптозу у тварин усіх груп вивчали по рівню ДНК–фрагментації в гомогенатах м'язовій тканині стегна. Показник фрагментації ДНК в інтактній м'язовій тканині у тварин 1 групи склав 6,49% . Після лігірування судинного пучка стегна (2 група тварин) фрагментація ДНК зросла і максимум деградації її спостерігався на 7 добу – 22,7% , що ймовірно співпадає з піком апоптозу в ішемізованій тканині. На 14 добу спостереження рівень деградації ДНК знизився до 17,8% , а на 30 добу склав 9,4% . При використовуванні неактивованої мазі у тварин 3 групи відсоток деградації ДНК в гомогенатах м’язів стегна збільшувався на першу добу до 8,2% , на 3 добу – до 12,11% , пік апоптозу спостерігався також на 7 добу, як і в 2 групі, але був достовірно нижче, і склав 19,4% . На 30 добу спостереження відсоток фрагментації ДНК складав 7,62% . У тварин 4 групи показники фрагментації ДНК в гомогенатах м’язів стегна були значно нижче, ніж в 2 (контрольній) і 3 (групі порівняння) групах тварин. Так, на 1 добу спостереження фрагментація ДНК склала 7,9% , на 3 добу – 10,58% , на 7 добу – 15,6% відповідно. Крім того, на 30 добу, на відміну від тварин 2 та 3 груп, у тварин 4 групи спостерігається зниження рівня деградації ДНК до початкового рівня, характерного для 1 групи – 6,04% .
Таким чином, при вивченні одержаних показників фрагментації ДНК в гомогенатах м’язів стегна щурів було з`ясовано, що при експериментальному моделюванні ішемічних та гнійно–запальних ускладнень цукрового діабету відбуваються достовірні порушення регуляції запрограмованої загибелі клітин м'яких тканин уражених нижніх кінцівок, що може привести до погіршення репаративних процесів. Місцеве застосування фотохімічно активованого 40% розчину мазі “Левомеколь” в комлексі з пероральним вживанням ферментного препарата серратіопептидази достовірно ефективно (p < 0,05) корегує порушення регуляції апоптозу клітин м'яких тканин уражених нижніх кінцівок.
Процеси перекисного окислення ліпідів та стан системи антиоксидантного захисту при гнійно–запальних процесах на фоні експериментального цукрового діабету . В процесі досліджень було виявлено зростання вмісту проміжних продуктів ПОЛ – дієнових кон'югатів та кінцевого продукту ПОЛ – МДА в еритроцитах та м`язовій тканині стегна щурів із експериментальним алоксановим діабетом, що є наслідком збільшення вмісту активних метаболітів кисню за умов інтенсифікації окисних процесів в цих клітинах при діабеті (табл. 2).
Результати досліджень свідчать про зниження активності вільнорадикальних процесів в тканинах діабетичних щурів під дією ФХА мазі “Левомеколь” в комплексі з пероральним застосуванням ферментного препарата серратіопептидази.
Таблиця 2
Вміст продуктів ПОЛ в тканинах щурів із алоксановим діабетом (M±m)
| Показник | Групи | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | ||
| Еритроцити | |||||
| Дієнові кон`югати, нмоль/мл | 1,0 ± 0,13 | 3,3 ± 0,14 | 1 | 3,7±0,11* | 3,8±0,13* |
| 2 | 2,4±0,06** | 1,5±0,09** | |||
| Малоновий діальдегід, мкмоль/мл | 50,0 ± 1,4 | 119,1 ± 4,9 | 1 | 127,8±3,1* | 129,6±2,7* |
| 2 | 85,7 ±1,5** | 48,1±2,6*, ** | |||
| М`язова тканина | |||||
| Дієнові кон`югати, нмоль/мг білка | 51,8 ± 3,2 | 91,4 ± 1,2 | 1 | 96,2±1,2* | 99,2±1,4* |
| 2 | 77,2±1,1** | 53,5±3,0*, ** | |||
| Малоновий діальдегід, мкмоль/мг білка | 127 ± 5,4 | 306 ± 17,6 | 1 | 311 ±15,2* | 314 ±12,7* |
| 2 | 197±8,3*, ** | 133 ±4,6** | |||
Примітки: 1 – показники до лікування; 2 – показники після лікування; *– для цих значень таблиці Р < 0,05 (де Р оцінено між 4 та 3 групою); **– для цих значень таблиці р < 0,05 (де р оцінено між терміном після операції і початком лікування ).
Вміст продуктів ПОЛ (дієнових кон`югатів та МДА) значно знижувався як в еритроцитах, так і в м`язовій тканині стегна (див. табл. 2). В основі протиперекисної дії ФХА, можливо, лежить його здатність пригнічення вироблення ендогенних вільних радикалів фагоцитамиза рахунок зниження активності ферменту цитоплазматичної мембрани NADPH–оксидази, що є основним джерелом супероксиданіона (L. M. Hulten, 1999).
Для м`язової тканини характерною особливістю є значна інтенсивність протікання процесів окислення, в тому числі і ПОЛ. Відповідно, в клітинах м`язів стегна спостерігався більш високий, в порівнянні з еритроцитами, вміст дієнових кон'югатів та МДА. Оскільки м`язова тканина належить до інсулінчутливих тканин, за умов цукрового діабету знижується швидкість фосфорилювання глюкози в глюкозо–6–фосфат, і, як наслідок, зростає інтенсивність ліполізу, а отже і вміст вільних ненасичених жирних кислот, які здатні окислюватись шляхом пероксидації. Виявлені при діабеті зміни вмісту продуктів ПОЛ пов'язані із модифікацією антиоксидантних ферментів як активним киснем, так і глюкозою (табл. 3).
Зростання вмісту активних кисневих метаболітів в клітинах м`язів стегна внаслідок інтенсифікації ліполізу та ПОЛ, супроводжується достовірним підвищенням активності супероксиддісмутази (СОД) та каталази (див. табл. 3). Ріст активності СОД та каталази в клітинах м`язів стегна при одночасному зниженні в крові швидше за все обумовлений підвищеним синтезом ферменту у вогнищі гнійного запалення у відповідь на надлишкову продукцію вільних радикалів. У крові ж відбувається виснаження запасів ферментів, що також витрачаються на нейтралізацію вільних радикалів, що потрапили в кровообіг.
Таблиця 3
Активність ферментів антиоксидантного захисту та вміст GSHв м`язах стегна щурів із алоксановим діабетом (М ± m)
| Показник | Групи | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | ||
| Активність СОД, ум.од./мг білка | 0,53 ± 0,054 | 0,21 ±0,01 | 1 | 0,67 ±0,01* | 0,69 ±0,01* 0,57 ±0,02* |
| 2 | 0,42 ±0,01* | ||||
Активність каталази, мкмоль/(мг ´ хв) білка |
2,9 ±0,1 | 4,6 ±0,15 | 1 | 4,7 ±0,13 | 4,5 ±0,15 3,4 ±0,12*, ** |
| 2 | 3,9 ±0,11* | ||||
| Активність ГПО, мкмоль GSH/хв/мг білка | 242,4 ± 9,5 | 228,7 ±10,8 | 1 | 222,3 ±8,5* | 221,5 ±9,1 |
| 2 | 237,2 ±9,4** | 260,0 ±9,6** | |||
| Активність ГР, нмоль NADPH/хв/мг білка | 2,3 ± 0,04 | 2,8 ±0,03 | 1 | 2,7±0,03* | 2,9±0,03* |
| 2 | 3,6 ±0,02*, ** | 3,7±0,02*, ** | |||
| Вміст GSH, мг/г білка | 3,0 ± 0,23 | 1,31 ± 0,09 | 1 | 1,33 ±0,05* | 1,32 ±0,04* |
| 2 | 2,12 ±0,12** | 2,91 ±0,12** | |||
Примітки : 1 – показники до лікування; 2 – показники після лікування;
* – для цих значень таблиці Р< 0,05 (де р оцінено між 4 групою та 3 групою);
** – для цих значень таблиці Р < 0,05 (де Р оцінено між терміном після операції і початком лікування).
При алоксановому діабеті вміст відновленого глутатіону(GSH) знижувався як в еритроцитах, так і в м`язовій тканині. Причина зменшення концентрації GSH пов'язана не тільки з посиленням його використання та недостатнім відновленням, тобто із зміною активності глутатіонпероксидази (ГПО) та глутатіонредуктази (ГР), але і з порушенням синтезу та обміну глутатіону.
В еритроцитах та м`язах щурів із алоксановим діабетом спостерігалось зростання активності глутатіонредуктази, спричинене збільшенням вмісту відновленого нікотинамідаденіндинуклеотидфосфату (NADPH) при діабеті. Активність ГР була спряжена з функціонуванням ГПО, яка окислює глутатіон, відновлюючи гідроперекиси ліпідів та інших органічних сполук. Активність ГПО при діабеті знижувалася внаслідок алостеричного інгібування ферменту NADPH.
Результати дослідження глутатіон-глутатіонредуктазної системи представлені в таблиці 3. Місцеве введення фотохімічно активованого 40% розчину мазі “Левомеколь” в комплексі з пероральним застосуванням ферментного препарата серратіопептидази викликало в еритроцитах тварин 4 групи достовірне зростання активності важливих ферментів антиоксидантного захисту – СОД та каталази (див. табл. 3). Вміст відновленого глутатіону і глутатіонредуктазна активність в еритроцитах щурів 4 групи наближались до норми (див. табл. 3).
Спостерігався дещо підвищений рівень активності ГПО. Ми пояснюємо це тим, що при місцевому введенні ФХА мазі “Левомеколь” в комплексі з пероральним застосуванням ферментного препарата серратіопептидази зростає співвідношення NADP/NADPHі, відповідно знижується алостеричне інгібування ГПО за участю NADPH.
В м`язовій тканині стегна щурів 4 групи після введення ФХА мазі “Левомеколь” в комплексі з пероральним застосуванням ферментного препарата серратіопептидази спостерігалася нормалізація активності СОД та ГПО, в той час як активність каталази залишалася підвищеною (див. табл. 3). Рівень GSH в м`язовій тканині стегна щурів 4 групи підвищувався і досягав значення, характерного для 1 (інтактної) групи щурів, а активність ГР збільшувалася, що було зумовлено посиленням синтезу глутатіону.
Таким чином, при експериментальному алоксановому діабеті у щурів в еритроцитах спостерігалося зростання вмісту дієнових кон'югатів та малонового диальдегіду, що супроводжувалося зниженням активності ферментів антиоксидантного захисту – супероксиддісмутази та еритроцитарної глутатіонпероксидази, а також зростанням активності глутатіонредуктази. Одночасно спостерігалося зростання активності каталази та СОД в клітинах м`язів стегна, що, очевидно, слід розглядати як компенсаторну реакцію у вогнищі гнійного запалення у відповідь на надлишкову продукцію вільних радикалів (“оксидативний стрес”).
Місцеве введення ФХА мазі “Левомеколь” в комплексі з пероральним застосуванням ферментного препарата серратіопептидази викликало достовірне зниження вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів та нормалізацію активності ферментів антиоксидантного захисту. захисту при експериментальному алоксановому діабеті.
Клінічні результати та їх обговорення. Проведені дослідження показали, що у хворих з гнійно–запальними ускладненнями синдрому діабетичної стопи був достовірно погіршений стан перфузії в тканинах нижніх кінцівок.
Це виявилося найбільшою мірою у порушенні мікроциркуляції та морфологічних змінах капілярів. Зокрема, однією з передумов для цього було зменшення на 31% кількості капілярів дистальних відділів нижньої кінцівки в порівнянні з верхньою. Капіляри нижньої кінцівки були значно розширені, більш звиті, гірше візуалізувалися. Навкруги судин був значно виражений периваскулярний набряк, внаслідок чого у 21% хворих капіляри на нижній кінцівці не візуалізувалися. Ці зміни, у свою чергу, створювали сприятливі умови для більш вираженого стаза крові. Так, нормальний кровоток в капілярах нижньої кінцівки зустрічався в 3 рази рідше в порівнянні з верхньою. Сумарна рангова оцінка мікроциркуляції нижньої кінцівки в 1,4 рази нижче, ніж верхньої.
Киснезабезпечення тканин стопи в обох групах хворих з гнійно–запальними ускладненням СДС до лікування характеризувалася погіршенням показників кисневого режиму по мірі прогресування гнійно–запального процесу, на що вказувало достовірне (Р < 0,05) зниження черезшкірної напруги кисня в спокої (ТсpO2 ) та показників ішемічної проби (Vпад ТсpO2 та Vприр ТсpO2 ), а також підвищення індекса регіонарної перфузії (ІРП). На 20–ту добу лікування хворих основної групи при локальному гнійно–запальному процесі ТсpO2 зростав на 9,86% , Vпад ТсpO2 – на 24,14% , Vприр ТсpO2 – на 146,15% , а ІРП знижувався на 10,54% відносно показників кисневого режиму до лікування. При поширеному гнійно–запальному процесі ТсpO2 зростав на 19,82% , Vпад ТсpO2 зростав на 28,57% , Vприр ТсpO2 зростав на 239,02% , а ІРП знижувався на 9,49% . На 20 добу лікування хворих контрольної групи при локальному гнійно–запальному процесі ТсpO2 зростав на 6,89% , Vпад ТсpO2 – на 8,77% , Vприр ТсpO2 – на 61,42% , а ІРП знижувався на 4,87% відносно показників кисневого режиму до лікування. При поширеному гнійно–запальному процесі ТсpO2 зростав на 9,33% , Vпад ТсpO2 – на 26,47% , Vприр ТсpO2 – на 88,09% , а ІРП знижувався на 3,37% .
У всіх хворих основної та контрольної групи, у яких пульс на артерії тилу стопи та задньогомілковій артерії не визначався, плече–кісточковий індекс був не менше ніж 0,6, тобто мав місце компенсований колатеральний кровоток.
За нашими спостереженнями, гнійно–запальні процеси у хворих на ЦД мали тенденцію до поширення, особливо по ходу сухожилків, фасцій, апоневрозу та підшкірній жировій клітковини. При незміненій шкірі, відсутності вираженого набряку підшкірної клітковини, наявності невеликого вогнища ззовні він поширювався по глиб лежачих м`яких тканинах на значну відстань, часто втягуючи в процес кістково–суглобовий апарат стопи. Нами було встановлено, що особливістю ранового процесу при гнійно–запальних ускладненнях СДС являлася відсутність чіткої фазності процесу. Для хворих на ЦД була характерною наявність усіх фаз ранового процесу в різних ділянках рани одночасно, що підтверджувалося в нашій роботі за допомогою цитологічних методів контролю.
Проведені в динаміці дослідження показали, що очищення ран у хворих основної групи наставало на 3,7 ± 0,1 добу, рани активно гранулювали на 5,3 ± 0,2 добу, а швидкість загоєння ран за даними планіметрії склала 5,57% ± 0,25% на добу. У хворих контрольної групи очищення ран наставало на 10,5 ± 0,5 добу, активні грануляції з'являлися до 17,6 ± 0,3 доби, швидкість загоєння склала 1,78% ± 0,15% на добу. Усі приведені параметри достовірно відрізняються у хворих основної групи і групи співставлення (Р < 0,05).
У хворих основної групи до 20 доби більшість ран (83,3% ) були чисті, або з помірним серозним рановим вмістом, із крайовою епітелізацією, 12,5% ран було закрито вторинними швами.
У хворих контрольної групи на 20 добу відзначалися рани з рясним серозним, серозно–гнійним, рідше з гнійним вмістом. Вторинний шов був накладений лише у 4,2% хворих.
Цитологічне дослідження ранових мазків–відбитків встановило, що зміни клітинного складу ранової поверхні під час лікування суттєво відрізнялися у хворих основної групи і контрольної групи. Крім того, нами було виявлено, що активність і характер фагоцитозу відрізнялися у хворих з різними видами гнійно–запальних захворювань і залежали від поширеності процесу. Так, у хворих контрольної групи співставлення процеси очищення рани на 7–11 добу лікування відбувалися повільніше порівняно з основною групою. На 12–15 добу лікування в основному спостерігався запальний тип цитограми за Д. М. Штейнбергом. Лише починаючи з 16 ± 2,3 доби відмічалася поява зон в рані з запально–регенераторним типом цитограм, а в окремих хворих лише після 20–ї доби з моменту початку лікування.
В основній групі на 20 добу лікування в 60% випадків переважав регенераторний тип цитограми, запально–регенераторний тип був у 35% , в 5% обстежених хворих визначався запальний тип цитограми. У ті ж самі строки у хворих контрольної групи регенераторний тип цитограми спостерігався лише у 17,5% хворих, у 24,9% був запально–регенераторний тип цитограми, запальний тип встановлено в 57,6% випадків.
Таким чином, характер змін цитограми у хворих основної та контрольної груп був односпрямованим. Однак зміни, що виражалися в поступовому зменшенні кількості нейтрофілів, збільшенні кількості макрофагів, лімфоцитів і фібробластів, зменшенні числа дегенеративних форм клітин, відновленні фагоцитарної активності, появі клітин епітелію, у хворих основної групи з'являлися достовірно раніше в порівнянні з контрольною групою. Таким чином, запропонований комплекс хірургічного лікування з застосуванням місцевого фотохімічного впливу достовірно ефективніше стимулює репаративні процеси в рані, ніж традиційне лікування.
При вивченні процесів перекисного окислення ліпідів у крові та тканинах рани обстежених хворих були виявлені порушення прооксидантно–антиоксидантної рівноваги, що також підтверджується і отриманими експериментальними даними. Так, кількість дієнових кон’югат та малонового діальдегиду, по яких судили про активність перекисного окислення ліпідів, у крові хворих із гнійними ранами на 2 добу була в 1,6 та 2,41 рази відповідно вище норми. Активність СОД та каталази в еритроцитах хворих основної групи склала в середньому 1,542 ± 0,004 ум. од./мл і 2,2 ± 0,14 мкмоль/(хв ´ мг) Нb, що в 1,53 та 1,09 рази нижче норми відповідно; у хворих контрольної групи – в 1,52 та 1,09 рази нижче норми відповідно (Р < 0,05). Активність СОД та каталази в гомогенатах біоптатів стінок і дна гнійної рани хворих основної групи склала в середньому 1,12 ± 0,01 ум. од./мг і 4,33 ± 0,14 мкмоль/(хв ´ мг), що в 2,12 та 1,48 рази вище норми; у хворих контрольної групи співставлення – в 2,11 та 1,43 рази вище норми відповідно (Р < 0,05). В еритроцитах та гомогенатах біоптатів стінок і дна гнійних ран хворих обох груп до лікування спостерігалось достовірне (Р < 0,05) зростання активності ГР, яке слід розцінювати як адаптаційну реакцію на збільшення вмісту відновленого NADPH. Так, активність ГР в еритроцитах та гомогенатах біоптатів стінок і дна гнійних ран хворих основної групи, як і групи контролю, зростала в 1,09 та 1,21 рази відповідно норми. Активність ГПО при діабеті знижується внаслідок алостеричного інгібування ферменту NADPH. Так, активність ГПО в еритроцитах та гомогенатах біоптатів стінок і дна гнійних ран хворих основної групи, як і контрольної групи, була нижче норми в 1,43 та 2,62 рази відповідно.
На 20 добу у хворих основної групи вміст дієнових кон’югат та малонового діальдегіда у тканинах зменшився в 2,03 та 2,14 рази відповідно впорівнянні з початком лікування (в контрольній групі – в 1,59 та 1,70 рази відповідно менше в порівнянні з початком лікування). На 20 добу лікування у хворих основної групи активність СОДта каталази
8-09-2015, 22:34